Otimização da técnica de PCR para detecção de Xylella fastidiosa em insetos vetores associados a cafeeiro

Abstract

Xylella fastidiosa é uma bactéria gram-negativa limitada ao xilema, que causa doenças em várias plantas de interesse econômico. No Brasil, foi relatada causando escaldadura da folha de ameixeira, clorose variegada dos citros (CVC) e depauperamento em cafeeiro. O principal meio de transmissão desta bactéria ocorre através de insetos sugadores do xilema. Este trabalho teve como objetivo o desenvolvimento da técnica de PCR (Polymerase Chain Reaction) para detecção de X. fastidiosa em insetos vetores. Cigarrinhas coletadas em cafezais no Paraná tiveram o DNA total extraído segundo os métodos propostos por Vega et al. (1993), Cheung et al. (1993) e pela extração utilizando a resina CHELEX 100. Devido à baixa sensibilidade apresentada pelo PCR, foi desenvolvido o nested-PCR. Esta técnica envolve inicialmente a amplificação de fragmento de DNA, utilizando primeiramente um par de "primers", e a seguir o produto deste PCR serve como molde para uma segunda amplificação usando um novo conjunto de "primers", internos à seqüência amplificada no primeiro PCR. Os "primers" utilizados para amplificar o DNA de X. fastidiosa presente em cigarrinhas foram: 272-1 e 272-2 e RST31-RST33, para o primeiro PCR; e CVC-1 e 272-2 interno e RST31-RST33 internos, para o segundo PCR (nested PCR). O nested-PCR mostrou-se mais sensível e específico, utilizando os "primers" RST31-RST33 no primeiro PCR e RST31-RST33 internos no segundo PCR, para detecção de X. fastidiosa em cigarrinhas.

Optimization of the PCR technique for the detection of Xylella fastidiosa in insect vectors associated wi th coffee trees. Xylella fastidiosa is a Gram negative xylem-limited bacterium responsible for economic losses in several agriculturally important plants. In Brazil, the bacterium causes plum leaf scald, citrus variegated chlorosis (CVC) and coffee leaf scorch (CLS). X. fastidiosa is transmitted by xylem feeding leafhoppers. The subject of this work was to develop a PCR (Polymerase chain reaction) protocol for detection of X. fastidiosa in potential insect vectors. Leafhoppers collected in coffee plantations in Paraná State were used for DNA extraction according to methods proposed by Vega et al. (1993), and Cheung et al. (1993), and by the method using the resin CHELEX 100. Due to low sensibility on regular PCR, the nested-PCR procedure was developed. This technique involves an initial amplification of DNA fragment by using an external set of primers. Next, the product of this PCR is used as template for a second amplification using a new set of primers, internal to the sequence amplified in first round of PCR. The primers used to amplify the DNA of X. fastidiosa were: 272-1 and 272-2, and RST31-RST33 for first round of PCR and CVC-1 and 272-2 int, and RST31int-RST33 int for the second PCR, respectively. The nested PCR using the RST sets of primers was highly sensitive and specific for detection of X. fastidiosa in potential insect vectors.