O uso de ferramentas genômicas para seleção assistida representa um avanço tecnológico para programas de melhoramento de espécies perenes, como o café. Aqui se apresenta um conjunto de marcadores moleculares para seleção de cafeeiros sem cafeína. O objetivo é validar marcadores moleculares para seleção assistida. Os marcadores foram identificados no gene caffeine synthase, comparando-se sequências de plantas normais e de AC1, uma planta naturalmente livre de cafeína. A análise molecular dessas sequências genômicas indicou a ocorrência de Single Nucleotide Polymorphims (SNPs) em domínios proteicos, potencialmente associados à síntese de cafeína. Progênies de populações do cruzamento entre AC e cultivares elite foram avaliados tanto em relação ao teor de cafeína em grãos quanto ao perfil de segregação genômica para os SNPs selecionados. Essa genotipagem permitiu a discriminação entre plantas homozigotas e heterozigotas para o alelo mutante. Análises estatísticas mostraram uma associação entre a presença dos SNPs e a redução do teor de cafeína. Além disso, essa associação ocorreu em todos os genótipos avaliados, com diferentes origens genéticas e gerações de cruzamentos, indicando uma estabilidade do padrão de herança da característica e dos marcadores. Os marcadores moleculares descritos representam um caso bem-sucedido de seleção assistida no café, indicando seu potencial uso para o desenvolvimento de cultivares livres de cafeína.